如何设计引物

做遗传分子实验的人经常会需要设计引物。设计引物本身很简单，但是没有做过的话根本不知道如何下手。引物一般需要一对，分别是正向引物和反向引物。这里教大家如何一步步设计这两个引物。在设计之前你需要有一个可以设计引物的软件，我个人习惯用DNAMAN，网上可以下载到，很好用。

工具/原料

DNAMAN

目的基因

正向引物设计

1、首先要拿到自己要设计引物的目的基因。这里我使用一段GFP基因给大家讲解。将目的基因保存在txt文档里面，或者直接复制下来后在DNAMAN里面新建文档复制进去。下面是我们要设计引物的GFP基因序列。

3、再次点击Primer，选择Melting Temperature，打开对话框。这里面可以看到你的碱基序列，个数以及Thermo，也即Tm值，是溶解温度。Tm值一般在55℃到70℃之间比较好，PCR仪的退火温度一般设定比primer的Tm低5℃（不过一般情况我们都设定为55℃，因此Tm值在60左右比较好）。

4、从上图可以看到我们这20个碱基的Tm值只有49度，显然太低，需要增加碱基数量。我们取前24个碱基粘贴进去，点击下方Show Tm便可以看到这个引物的Tm值，发现是60.3度，很合适，就用这个了。这样正向引物就设计完了，把这24个碱基序列保存下来。

4、保持Channel 1选中的状态，选择Sequence-->Display Sequence，打开对话框。

6、这样就可以看到目的基因的反向互补序列了。

8、至于拿到引物后如何使用PCR仪扩增目的基因，相信大家实验室都有会操作的人，简单教一下就会知道。如果有不知道的可以在这个经验下面提问我，我可以根据情况再写一篇如何使用PCR仪的经验。